Tahmini okuma süresi: 3 dakika

Sinonim: protein immunoblot, Westernblot, Immunblot

W. Neal Burnette

Tekniğin kökeni 1979’da Friedrich Miescher Enstitüsündeki Harry Towbin’in laboratuvarına dayanır.Bu tekniğin ismi  W. Neal Burnette tarafından verilmiştir, “Southern blot“(Güney lekesi) DNA üzerinde , “Northern Blot” (Kuzey lekesi) RNA üzerine tekniklerdir.Protein üzerine olan bu teknikte, bu iki teknik isminden yola çıkarak Western blot(Batı lekesi) adını almıştır.

  • Hem teşhis hem deneysel viroloji alanında kullanılır.Başta HIV enfeksiyonları olmak üzere Hepatit B gibi virüs enfeksiyonlarında teşhis amaçlı kullanılır.

Testin Uygulanışı:

Şekil 1
  1. Protein(antijenler) ilk önce jel elektroforezisine şekil 1’deki gibi pipetle konur.
  2. Uygun prosedür gerçekleştirilip, elektirik uygulanınca, proteinler elektrik yüklerine ve kitlelerine göre jel üzerinde şekil 2’deki gibi hareket ederek şekil 3’ü oluşturur.
  3. Jel  şekil 4 ‘deki gibi yerleştirilerek elektrik verilir, böylelikle jel içindeki proteinlerin membrana(nitro selülöz zar) transferi gerçekleştirilir.
  4. Şekil 2

    Membran üzerindeki nonspesifik bağlanma bölgeleri bloke edilir. Bloke etmek için süt veya sığır serum albumini kullanılır.

  5.  
    Şekil 3
    Western blot2
    Şekil 4

    Membrana bu aşamada birincil antikor eklenir, yani teşhis için yapılırsa test incelenecek serum eklenir.Ardından fazla antikorların membrandan uzaklaşması için yıkama yapılır.

  6. ikincil antikorlar eklenerek, birincil antikorlara bağlanması sağlanır ve ardından tekrar yıkama gerçekleştirilir.
  7. Renklendirme için enzim işaretleyici kromojenik substrat eklenir ve yıkama gerçekleştirilir. şekil 5’deki gibi reaksiyonlar tamamlanır.

    Şekil 5

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

  • Eğer serum içindeki antikorlar HIV virüsünün p24 ve gp41 bileşenlerine karşı tepki gösterirse, zar üzerinde renklenme oluşur.
  • HIV- western blot testinin pozitif olarak değerlendirilebilmesi için en az iki protein bandının pozitif olması gerekir.Bu bantlardan biri, env-bölgesi(gp41, gp120, gp160), diğeri de pol bölgesi(p32, p51, p66) veya gag bölgesinden(p17, p24, p55)  olmak zorundadır. Eğer bu koşulları dolldurmazsa, örnek belirsiz olarak değerlendirilir. Ardından en erken 4 hafta sonra test tekrar edilmelidir, eğer sonuç değişmezse yüksek olasılıkla HIV negatifdir. Fakat 6 ay sonra test tekrar edilir, sonuç tekrardan değişmez ise, serumda HIV enfeksiyonu için kanıt olmadığı hükmüne varılır. Ayrıca serumu kontrol edilen kişinin, kan, kan ürünleri veya organ bağışlamaması gerekir.
  • Şekil 6 ve Şekil 7’de HIV-western blot sonuçları gösterilmiştir, ilk çizgiler pozitif-kontrol, ikinci çizgiler negatif-kontroldür. sgp105 ve gp36 bantları HIV2 bantları, diğerleri HIV1 bantlarıdır.

    western blot 3
    1. sıra pozitif-kontrol, 2. sıra negatif-kontrol, 3. sıra HIV2 pozitif ve HIV1 belirsiz, 4. sıra HIV1 pozitif, 5. sıra negatif, 6. sıra HIV1 pozitif, 7. sıra HIV1 pozitif ve HIV2 belirsiz

 

western blot 4
1. sıra pozitif-kontrol, 2. sıra negatif-kontrol, 3. sıra negatif, 4. sıra HIV1 pozitif, 5. sıra HIV1 pozitif, 6. sıra belirsiz.
  • HIV antikorları hem ELİSA hemde Western-blot ile tespit edilebilir. ELISA testinin avantajı yüksek duyarlılığı, dezavantajı özgüllüğün düşük olmasıdır. Bu sebeble elisa testinde yanlış pozitif sonuçlar çıkabilir. Diğer yandan Western Blot testi yüksek özgüllüğe ve düşük duyarlılığa sahiptir. Bundan dolayı tanı için elisa testi kullanılır. Eğer pozitif sonuç çıkarsa ikincil ELISA ile doğrulanır. Eğer ikinci testin sonucu doğru çıkarsa Western blot ile onaylanır, eğer western blot testi de pozitif çıkarsa, ikinci bir serum örneği ile tasdik edilir.
Facebook Yorumları